جداسازی و کشت سلول‌های اسپرماتوگونی گاو و بررسی اثر فاکتور رشد اپیدرمال بر تعداد سلول‌ها، اندازه کلونی‌ها و میزان زنده‌مانی اسپرماتوگونی

نوع مقاله : مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 گروه علوم دامی دانشکده کشاورزی دانشگاه تبریز

2 گروه علوم درمانگاهی دانشکده دامپزشکی دانشگاه تهران

چکیده

زمینه مطالعاتی: فاکتور رشد اپیدرمال می­تواند باعث افزایش تعداد سلول­ها، اندازه کلونی‌ها و میزان زنده‌مانی سلولهای بنیادی اسپرماتوگونی گردد. هدف: این آزمایش به منظور بررسی اثر فاکتور رشد اپیدرمال بر تعداد سلول­ها، اندازه کلونی‌ها و میزان زنده‌مانی اسپرماتوگونی انجام گرفت. روش­کار: در این مطالعه سلول‌های اپیتلیوم لوله‌های منی‌ساز از بیضه گوساله با استفاده از مراحل هضم آنزیمی و DSA لکتین جداسازی شدند. ماهیت سلول‌ها علاوه بر ریخت‌شناسی و فعالیت آنزیم آلکالین فسفاتاز، از طریق نشانگرهای اختصاصی Oct-4 و ویمنتین در سلول‌های کلونی و سرتولی تأیید شدند. برای تعیین شرایط مناسب کشت و غنی‌سازی سلول‌ها، تعلیق سلولی حاوی سلول‌های بنیادی به صورت هم کشت با سلول سرتولی و افزودن غلظت‌های متفاوت از فاکتور رشد EGF کشت داده شد. در طول 2 هفته دوره کشت، میزان کلونیزاسیون، با میکروسکوپ نوری اندازه گیری شد. در آخرین مرحله، این سلولها در محیط In vitro منجمد-ذوب شدند تا درجه خلوص و قدرت زیست سلول‌های بنیادی ارزیابی شود. نتایج: در بررسی سطح به صورت کلی، در تیمار با غلظت 50 نانوگرم EGF افزایش سطح تغییر معنی‌دار بود (05/0P <)، در بررسی کلونی‌های با قطر بزرگتر از 114/0 میلی‌متر (± SE)، افزایش قطر کلونی‌ها در غلظت 50 نانوگرم معنی‌دار بود (05/0P <)، اما در اندازه کلونی‌ها در شمارش روز آخر تغییر معنی‌داری در هیچ کدام از گروه های آزمایشی دیده نشد (05/0 P ≥). نتیجه‌گیری نهایی: مطالعه حاضر نشان می‌دهد که می‌توان سلول‌های بنیادی اسپرماتوگونی را با درجه خلوص بالا از بیضه گوساله جدا کرد و همچنین از رابطه متقابل بین سلول‌های بنیادی اسپرماتوگونی و سلول‌های سرتولی و بعضی فاکتورهای رشد برای شروع، حفظ فرایند اسپرم‌زایی و غنی‌سازی سلول‌های بنیادی در طی کشت و افزایش درجه خلوص و قدرت زیست آنها در طی انجماد استفاده کرد. درتجزیه و تحلیل آماری از آزمون ANOVA استفاده شد و P <0.05، به عنوان سطح معنی‌دار در نظر گرفته شد.

کلیدواژه‌ها


عنوان مقاله [English]

Isolation and maintenance of calves type A spermatogonia in vitro: in influence of epidermal growth factor on number of cells, colony size and spermetogoia viability

نویسندگان [English]

  • M Torkzaban 1
  • Gh Moghaddam 1
  • P Tajik 2
  • A Barin 2
Akmal KM, Dufour JM, Kim KH, 1997. Retinoic acid receptor alpha gene expression in the rat testis: potential role during the prophase of meiosis and in the transition from round to elongating spermatids, Biology of Reproduction. 56: 549–556.
Anjamrooz SH, Movahedin M, Tiraihi T, Mowla S J, 2006. In vitro effects of epidermal growth factor, follicle stimulating hormone and testosterone on mouse spermatogonial cell colony formation, Reprod Fertil Dev. 18: 709-720.
Anway MD, Folmer J, Wright WW, Zirkin BR, 2003. Isolation of sertoli cells from adult rat testes: an approach to ex vivo studies of Sertoli cell function, Biol Reprod. 68(3):996-1002.
Aponte PM, van Bragt MP, de Rooij DG, van Pelt AM. Spermatogonial stem cells: characteristics and experimental possibilities. APMIS. 2005; 113: 727-742.
Aponte PM, Soda T, van de Kant HJ, de Rooij DG, 2006. Basic features of bovine spermatogonial culture and effects of glial cell line-derived neurotrophic factor, Theriogenology. 65: 1828-1847.
Aponte PM, & de Rooij D G, 2008. Biomanipulation of Bovine Spermatogonial Stem Cells, AnimReprod
.5: 16-22.
Besmer P, Manova K, Duttlinger R, Huang EJ, Packer A, Gyssler C, 1993. Bachvarova RF. The kit-ligand (steel factor) and its receptor c-kit/W: pleiotropic roles in gametogenesis and melanogenesis, Development Suppl. 118: 125-137.
Brinster RL, NaganoM, 1998 .Spermatogonial stem cell transplantation cryopreservation and culture, Semin Cell Dev BioL.  9: 401-409.
Caires K, Broady J, McLean D, 2010. Maintaining the male germline: regulation of spermatogonial stem cells, J Endocrinol. 205(2):133-45.
Creemers LB, den Ouden K, van Pelt AM, de Rooij DG, 2002. Maintenance of adult mouse type A spermatogonia in vitro: influence of serum and growth factors and comparison with prepubertal spermatogonial cell culture, Reproduction. 124: 791-799.
de Kretser DM, Loveland KL, Meinhardt A, Simorangkir D, Wreford N, 1998. Spermatogenesis, Hum Reprod. 13 Suppl 1: 1-8.
Goossens E, Frederickx V, De Block G, Van Steirteghem AC, Tournaye H, 2003. Reproductive capacity of sperm obtained after germ cell transplantation in a mouse model, Hum Reprod.18 (9): 1874-80.
Herrid M, Davey R J, & Hill J R, 2007. Characterization of germ cells from pre-pubertal bull calves in preparation for germ cell transplantation, Cell Tissue Res. 330(2): 321-9.
Izadyar F, Matthijs-Rijsenbilt JJ, den Ouden K,Creemers LB, Woelders H, de Rooij DG, 2002. Development of a cryopreservation protocol for type A spermatogonia, J Androl. 23: 537-45.
Izadyar F, Den Ouden K, Creemers LB, Posthuma G, Parvinen M, De Rooij DG, 2003. Proliferation and differentiation of bovine type A spermatogonia during long-term culture, Biol Reprod. 68: 272-281.
Jeong D, McLean DJ, Griswold MD, 2003. Long-term culture and transplantation of murine testicular germ cells, J Androl, 24: 661-669.
Kanatsu-Shinohara M, Ogonuki N, Inoue K, Miki H,Ogura A, Toyokuni S, et al, 2003a. Long-term proliferation in culture and germline transmission of mouse male germline stem cells, Biol Reprod. 69: 612-616.
Kanatsu-Shinohara M, Ogonuki N, Inoue K, Ogura A, Toyokuni S, Shinohara T, 2003b. Restoration of fertility in infertile mice by transplantation of cryopreserved male germline stem cells, Hum Reprod. 18: 2660-2667.
Kanatsu-Shinohara M, Miki H, Inoue K, Ogonuki N, Toyokuni S, Ogura A, et al, 2005a. Long-term culture of mouse male germline stem cells under serum-or feeder-free conditions, Biol Reprod. 72: 985-991.
Kanatsu-Shinohara M, Ogonuki N, Iwano T, Lee J, Kazuki Y, Inoue K, et al, 2005b. Genetic and epigenetic properties of mouse male germline stem cells during long-term culture, Development. 132: 4155-4163.
Koruji M, 2007. Autograft of fresh and freezed spermatogonial cells of adult mouse after coculture with sertoli cells and treatment with GDNF, SCF and GM-CSF cytokines to the azoospermic mice with Gamma-Ray, Presented for the Ph.D., Tehran. Tarbiat Modares University.
Koruji M, Movahedin M, Mowla SJ, Gourabi H, Arfaee AJ, 2009. Efficiency of adult mouse spermatogonial stem cell colony formation under several culture conditions, In Vitro Cell Dev Biol Anim. 45: 281-289.
Kubota H, Avarbock MR, Brinster RL, 2004. Growth factors essential for self-renewal and expansion of mouse spermatogonial stem cells, Proc Natl Acad Sci USA. 101: 16489-16494.
Lamb DJ, Spotts GS, Shubhada S, Baker KR, 1991. Partial characterization of a unique mitogenic activity secreted by rat Sertoli cells, Mol Cell Endocrinol. 79(1-3):1-12.
Liu S, Tang Z, Xiong T, Tang W, 2011. Isolation and characterization of human spermatogonial stem cells, Reprod Biol Endocrinol. 9:141.
Nagano M, Patrizio P, Brinster RL, 2002. Long-term survival of human Spermatogonial stem cells in mouse testes, Fertil Steril. 78: 1225- 1233.
Ning L, Goossens E, Geens M, Saen DV, Tournaye H, 2012. Spermatogonial stem cells as a source for regenerative medicine, Mid East Fertil Soc J.17:1-7.
Oatley JM, Brinster RL, 2006. Spermatogonial stem cells, Methods Enzymol.419:259-82.
Ogawa T, Dobrinski I, Avarbock MR, Brinster RL, 1999. Xenogeneic spermatogenesis following transplantation of hamster germ cells to mouse testes, Bioi Reprod. 60(2):515-21.
OkeBO, Suarez-Qui and CA, 1993. Localization of secretory, membrane-associated and cytoskeletal proteins in rat testis using an improved immunocytochemical protocol that employs polyester wax, Bioi Reprod. 48: 621-631.
Orth JM, Jester WF, Li LH, Laslett AL, 2000. Gonocyte-Sertoli cell interactions during development of the neonatal rodent testis, CUff Top Dev BioI. 50: 103-24. Review.
Phillips BT, Gassei K, Orwig KE, 2010. Spermatogonial stem cell regulation and spermatogenesis, Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 365(1546):1663-78.
Pramod RK, Mitra A, 2014. In vitro culture and characterization of spermatogonial stem cells on Sertoli cell feeder layer in goat (Capra hircus), J Assist Reprod Genet.31 (8):993-1001
Radford J, Shalet S, Lieberman B, 1999. Fertility after treatment for cancer. Questions remain over ways of preserving ovarian and testicular tissue, BMJ. 319: 935-6.
Radhakrishnan B, Oke BO, Papadopoulos. V, DiAugustine RP, Suarez-Quian CA, 1992. Characterization of epidermal growth factor in mouse testis, Endocrinology. 131(6):3091-9.
Russell LD, 1993. Morphological and functional evidence for Sertoli-germ cell interactions In: Russell LD, Griswold MD (eds). The Sertoli Cell, Clearwater FL, Cache River Press: 365-390.
Scarpino S, Morena AR, Petersen C, Froysa B, Soder 0, Boitani CA, 1998. Rapid method of Sertoli cell isolation by DSA lectin, allowing mitotic analyses, Mol Cell Endocrinol. 146: 121-127.
Tegelenbosch RA, de Rooij DG, 1993. A quantitative study of spermatogonial multiplication and stemcell renewal in the C3H/101 F1 hybrid mouse, Mutat Res. 290: 193-200.
Toumaye H, Liu J, Nagy P, et aL, 1996. Correlation between testicular histology and outcome after intracytoplasmic sperm injection using testicular spermatozoa, Hum. Reprod. 11: 127-132.
Van Pelt AMM, van Dissel-Emiliani FM,Gaemers I, van der Burg  M, Tanke HJ, de Rooij DG, 1995. Characteristics of A spermatogonia and preleptotene spermatocytes in the vitamin A-deficient rat testis, Biology of Reproduction. 53: 570–578.